在組織工程支架開發(fā)中利用人工軟材料的重大努力顯示出對頜面骨再生的巨大潛力。然而，大多數(shù)生物材料無法同時滿足在咀嚼環(huán)境中的強(qiáng)韌粘附強(qiáng)度、病理免疫調(diào)控和高效細(xì)胞特異性靶向治療的多重要求，最終會損害修復(fù)過程。本書引入了一種含有間充質(zhì)干細(xì)胞來源納米囊泡（PEG-pp@nMSC@MT）的組織粘附水凝膠，結(jié)合炎癥調(diào)控和細(xì)胞特異性靶向，作為頜面骨修復(fù)的一體化工具。依靠 PEG-SG 活性酯基團(tuán)與 PEG-NH2 聚合物胺基之間的快速酰胺化反應(yīng)，均勻網(wǎng)絡(luò)迅速形成，易于注射、良好的生物相容性和強(qiáng)韌的粘附力，能夠抵抗口腔內(nèi)頻繁的咀嚼力?；|(zhì)金屬蛋白酶 2（MMP2）可切割肽的加入使水凝膠能夠響應(yīng)缺陷位點(diǎn)蛋白酶水平升高，從而按需釋放包裹的納米囊泡，同時抑制過量的 MMP2 活性。值得注意的是，治療性褪黑素高效運(yùn)輸?shù)筋A(yù)期的 BMMSCs，增強(qiáng)了其成骨和免疫調(diào)節(jié)功能。綜合而言，MMP2 的減少、BMMSCs 的抗炎因子分泌以及 nMSC@MT 的免疫調(diào)節(jié)作用協(xié)同促進(jìn)巨噬細(xì)胞向 M2 表型的極化，促進(jìn)骨骼再生。 PEG-pp@nMSC@MT 的治療效果優(yōu)于用于頜面骨缺損的一線移植材料 Bio-Oss，具有更優(yōu)越的生物降解性和骨誘導(dǎo)能力。因此，這一創(chuàng)新的水凝膠平臺結(jié)合了精準(zhǔn)的免疫調(diào)節(jié)與細(xì)胞特異性靶向，成為有效修復(fù)頜面骨缺損的有前景治療策略。

該研究以題為“MSC-mimicking nanovesicle embedded bio-adhesive hydrogel for dual immunomodulation and osteogenesis to promote maxillofacial bone regeneration”發(fā)表在Bioactive Materials上。

圖1

負(fù)載靶向間充質(zhì)干細(xì)胞功能性納米囊泡（PEG-pp@nMSC@MT）、兼具組織黏附與炎癥響應(yīng)特性的水凝膠用于促進(jìn)下頜骨再生的原理示意圖。a）活性酯基團(tuán)對組織蛋白具備高親和性，使該水凝膠可在骨缺損處實現(xiàn)組織黏附，既能避免其在力學(xué)載荷與潮濕環(huán)境下發(fā)生移位，又可實現(xiàn)藥物定點(diǎn)遞送。b）骨缺損部位基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）表達(dá)水平升高時，PEG-pp@nMSC@MT水凝膠可按需釋放nMSC@MT；該體系能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性，構(gòu)建適宜微環(huán)境以維持干細(xì)胞生理功能。c）宿主間充質(zhì)干細(xì)胞可特異性胞吞nMSC@MT，精準(zhǔn)調(diào)控自身增殖、成骨分化及免疫調(diào)節(jié)能力。以上多重機(jī)制協(xié)同作用，讓PEG-pp@nMSC@MT水凝膠有效助力頜面骨缺損修復(fù)再生。M1：巨噬細(xì)胞促炎表型；M2：巨噬細(xì)胞抗炎表型。

圖2

納米間充質(zhì)干細(xì)胞載褪黑素制劑（nMSC@MT）承襲原始間充質(zhì)干細(xì)胞特性，且可被骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞高效攝取。a）細(xì)胞膜經(jīng)DiI標(biāo)記、細(xì)胞質(zhì)經(jīng)Tht標(biāo)記的微囊泡典型共聚焦成像圖。比例尺：上方25微米，下方1微米。b）制備納米微囊泡載褪黑素制劑（nMSC@MT）的納米微囊泡與褪黑素共擠出流程示意圖。c）納米間充質(zhì)干細(xì)胞載褪黑素制劑的典型透射電鏡圖像。比例尺：100納米。d、e）動態(tài)光散射檢測納米微囊泡與納米間充質(zhì)干細(xì)胞載褪黑素制劑的粒徑及Zeta電位（樣本數(shù)n=3）。f、g）考馬斯亮藍(lán)染色與蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，微囊泡、納米微囊泡、納米間充質(zhì)干細(xì)胞載褪黑素制劑中均保留干細(xì)胞標(biāo)志物CD146、CD105、CD90以及功能蛋白CXCR4。h）可在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)觀察到紅色DiI標(biāo)記的納米間充質(zhì)干細(xì)胞載褪黑素制劑，證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過胞吞作用攝取該制劑。比例尺：10微米。i）免疫熒光結(jié)果顯示，水凝膠釋放出大量紅色DiI標(biāo)記的納米間充質(zhì)干細(xì)胞載褪黑素制劑，被綠色CD146標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞攝取。比例尺：50微米。j）采用流式細(xì)胞術(shù)檢測阻斷抗體（抗CXCR4抗體）存在條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對DiI標(biāo)記納米間充質(zhì)干細(xì)胞載褪黑素制劑的攝取情況。k）流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中DiI陽性細(xì)胞占比（樣本數(shù)n=3）。l、m）阻斷抗體（抗CXCR4抗體）干預(yù)下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞攝取DiI標(biāo)記納米微囊泡的免疫熒光染色圖及對應(yīng)的半定量分析結(jié)果（樣本數(shù)n=3）。比例尺：50微米。采用單因素方差分析結(jié)合圖基檢驗計算P值，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，n.s.代表差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3

復(fù)合聚脯氨酸或納米囊泡的水凝膠具備優(yōu)異的生物相容性與理化性能。a）實物照片展示聚乙二醇水凝膠、聚乙二醇負(fù)載納米間充質(zhì)干細(xì)胞與褪黑素水凝膠、聚乙二醇-聚脯氨酸負(fù)載納米間充質(zhì)干細(xì)胞與褪黑素水凝膠的制備流程及可注射性能，比例尺=0.5厘米。b）形貌表征證實該水凝膠擁有形態(tài)適配可塑性、延展性與界面生物黏附性，藍(lán)色染料提升宏觀可視效果，比例尺=5毫米。c）不同黏附材料在豬皮上的黏附應(yīng)力（樣本量n=3）。d）掃描電鏡典型圖像呈現(xiàn)聚乙二醇、聚乙二醇負(fù)載納米間充質(zhì)干細(xì)胞與褪黑素、聚乙二醇-聚脯氨酸負(fù)載納米間充質(zhì)干細(xì)胞與褪黑素三類水凝膠的內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)，比例尺=20微米。e）三類水凝膠的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線。f）三類水凝膠的溶脹性能；g）三類水凝膠的降解性能。h）基質(zhì)金屬蛋白酶酶切位點(diǎn)示意圖（樣本量n=3）。i）基質(zhì)金屬蛋白酶2濃度波動環(huán)境下，水凝膠中納米間充質(zhì)干細(xì)胞負(fù)載褪黑素的雙階段釋放曲線（樣本量n=3）。P值采用單因素方差分析結(jié)合圖基檢驗計算，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，n.s.代表無顯著差異。

圖4

水凝膠植入小鼠下頜骨缺損模型后的體內(nèi)骨再生效果評估。a）小鼠下頜骨缺損模型示意圖。b）術(shù)后4周、8周下頜骨樣本的顯微計算機(jī)斷層掃描三維重建圖像，比例尺=1毫米。c）術(shù)后8周植入不同水凝膠的小鼠下頜骨缺損區(qū)域骨體積分?jǐn)?shù)、骨表面積、骨小梁數(shù)量及骨小梁分離度的半定量分析（樣本量n=6）。d）術(shù)后8周下頜骨缺損組織切片的蘇木精-伊紅染色與馬松三色染色圖像，比例尺=100微米。e、f）術(shù)后4周、8周下頜骨缺損區(qū)域Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2、骨鈣素表達(dá)水平的免疫熒光染色圖像及對應(yīng)半定量分析（樣本量n=3），比例尺=50微米。采用單因素方差分析結(jié)合圖基檢驗計算P值，?p＜0.05、??p＜0.01、???p＜0.001，n.s.表示無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖5

PEG-pp@nMSC@MT水凝膠可在體外有效促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。a）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與水凝膠共培養(yǎng)示意圖。b）不同支架共培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞7天后的堿性磷酸酶染色結(jié)果，比例尺=500微米。c）堿性磷酸酶染色半定量分析（樣本量n=3）。d）不同支架共培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞21天后的茜素紅S染色結(jié)果，比例尺=500微米。e）茜素紅S染色半定量分析（樣本量n=3）。f）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在基質(zhì)金屬蛋白酶環(huán)境下經(jīng)不同水凝膠處理5天、10天后成骨基因（骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、骨鈣素、 Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2）的信使核糖核酸表達(dá)水平（樣本量n=3）。g）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在基質(zhì)金屬蛋白酶環(huán)境下經(jīng)不同水凝膠處理7天、14天后成骨蛋白（骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2）的蛋白質(zhì)免疫印跡分析結(jié)果。采用單因素方差分析結(jié)合圖基檢驗計算P值，?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，n.s.代表無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖6

PEG-pp@nMSC@MT水凝膠可促使骨缺損區(qū)域內(nèi)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型極化。a）該水凝膠免疫調(diào)節(jié)功能的示意圖；b）免疫熒光檢測結(jié)果、c）缺損部位培養(yǎng)1周后巨噬細(xì)胞極化水平半定量分析（樣本量n=3），比例尺=50微米；d）組織裂解液中細(xì)胞因子的信使核糖核酸表達(dá)水平（樣本量n=3）；e）組織裂解液中各類細(xì)胞因子（白介素-6、腫瘤壞死因子-α、白介素-1β、白介素-10、白介素-4）分泌特征熱圖（樣本量n=3）；f）巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶與甘露糖受體CD206免疫熒光染色的激光共聚焦熒光圖像，g）對應(yīng)免疫熒光染色半定量分析（樣本量n=3），比例尺=50微米。統(tǒng)計學(xué)差異采用單因素方差分析結(jié)合圖基檢驗計算，?p＜0.05、??p＜0.01、???p＜0.001，n.s.代表無統(tǒng)計學(xué)差異。

總結(jié)

頜面骨再生面臨咀嚼環(huán)境下的強(qiáng)粘附、免疫調(diào)控與靶向治療難以兼顧的問題。作者設(shè)計了一種含間充質(zhì)干細(xì)胞納米囊泡的PEG水凝膠，利用快速酰胺化反應(yīng)實現(xiàn)可注射和強(qiáng)韌粘附。加入MMP2可切割肽，使水凝膠響應(yīng)缺損部位蛋白酶升高而按需釋放囊泡，同時抑制過量MMP2活性。囊泡內(nèi)的褪黑素被精準(zhǔn)遞送至BMMSCs，增強(qiáng)其成骨與免疫調(diào)節(jié)功能。三者協(xié)同促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2極化，骨修復(fù)效果優(yōu)于一線材料Bio-Oss。

該水凝膠平臺的“響應(yīng)釋放+靶向調(diào)控”策略可拓展至其他炎癥驅(qū)動的骨缺損，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或糖尿病相關(guān)骨病。未來可替換不同的治療性分子或細(xì)胞外囊泡，實現(xiàn)對不同細(xì)胞亞型的精確編程。MMP2響應(yīng)模塊也可改為其他蛋白酶或pH敏感肽，適應(yīng)不同部位微環(huán)境。此外，結(jié)合3D打印可實現(xiàn)患者特異性形狀匹配，進(jìn)一步推動從頜面骨修復(fù)向顱骨、牙周組織等領(lǐng)域的臨床轉(zhuǎn)化。

參考文獻(xiàn)：

DOI: 10.1016/j.bioactmat.2026.02.032